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咖啡豆如何讓癌細胞凋亡?喝咖啡預防癌癥

POST TIME: 2017-07-04 23:06

咖啡豆醇通過上調ATF3誘導結腸癌細胞凋亡,回復170620可下載,一月有效
ATF3轉錄激活因子,activating tranion factor 3,屬于含亮氨酸拉鏈結構的轉錄因子ATF/CREB家族成員,是一個應激反應誘導基因。
咖啡豆醇介導人結腸癌細胞凋亡
使用0、12.5、25和50μM的咖啡豆醇處理HCT116細胞24小時,蛋白質印跡檢測斷裂的PARP。用25μM處理HCT116細胞,斷裂的PARP略微增加;50μM處理后顯著增加(Fig.1A)。
PARP(poly ADP-ribose polymerase)是DNA修復酶,是細胞凋亡核心成員caspase切割的底物,凋亡指標。
此外,使用50μM咖啡豆醇處理SW480、LoVo、HT-29細胞系,斷裂的PARP表達顯著增加(Fig.1B)。
結果表明:咖啡豆醇可能誘導人結腸直腸癌細胞凋亡。

ATF3表達有助于咖啡豆醇介導的細胞凋亡
用咖啡豆醇處理HCT116細胞24小時,使用ATF3抗體進行蛋白質印跡,劑量依賴性地增加ATF3蛋白水平(Fig.2A);
此外,在咖啡豆醇kahweol處理的SW480、LoVo、HT-29細胞也觀察到ATF3蛋白水平增加(Fig.2B);
在咖啡豆醇處理3小時后ATF3蛋白水平開始增加,24h達大值(應當再做個48h…當值持平或者下降時,挑出達到大值得小濃度劑量)(Fig.2C);
ATF3功能實驗:構建ATF3表達載體,咖啡豆醇處理,ATF3過表達增加了斷裂的PARP水平(Fig.2D);轉染siRNA敲除ATF3,減少了咖啡豆醇介導的斷裂PARP水平(Fig.2E)。
這些發現表明:咖啡豆醇介導的ATF3表達可能有助于人結腸癌細胞凋亡。

咖啡豆醇介導的ATF3表達來自轉錄調控
咖啡豆醇誘導HCT116、SW480、LoVo、HT-29細胞中ATF3的mRNA上調(Fig.3A),這與咖啡豆醇對ATF3蛋白水平的影響相似;
采用熒光素酶實驗測量ATF3啟動子活性,觀察到咖啡豆醇處理HCT116、SW480、LoVo、HT-29細胞后,增強了ATF3啟動子活性(Fig.3B);
在咖啡豆醇處理后3小時,ATF3啟動子開始活化(Fig.3C)。

CREB負責kahweol誘導的ATF3啟動子激活
為確定kahweol誘導的ATF3啟動子激活相關的特定位點,構建ATF3啟動子螢光素酶載體(pATF3-1420/+34、pATF3-718/+34、pATF3-514/+34、pATF3-318/+34,pATF3-147/+34和pATF3-84/+34)轉染到HCT116細胞中,用50μM的kahweol處理24小時;
pATF3-1420/+34和pATF3-718/+34,將ATF3啟動子活性提高了7倍(Fig.4A)
使用含有-147至-84區域的ATF3啟動子載體將活性提高了7倍,而沒有使用-147至-85區域的載體僅僅稍微增加了ATF3啟動子活性,這表明kahweol結合的相應位點/元件可能在-147到-85區域。據報道,Fushi tarazu(Ftz)和CREB是ATF3啟動子中的順式作用元件,含有-147至-85區域。為了鑒定是哪個順式作用元件起的作用,將每個位點缺失的ATF3啟動子載體轉染到HCT116細胞中,并用50μM的kahweol處理。
當CREB位點缺失時,kahweol誘導的ATF3啟動子活性顯著降低。然而,刪除Ftz位點并不影響kahweol誘導的ATF3啟動子活性(Fig.4B)。
這些數據表明CREB對于kahweol誘導的ATF3表達可能是重要的。

Kahweol誘導的ATF3表達依賴于ERK1/2和GSK3β
為了闡明咖啡豆醇與ATF3表達相關的上游激酶的關系,在HCT116細胞中預處理各種激酶抑制劑如PD98059(ERK1/2抑制劑)、SB203580(p38抑制劑)、SP600125(JNK抑制劑)、LiCl(GSK3β抑制劑)。
添加ERK1/2抑制劑PDK18059、GSK3β的抑制劑LiCl,顯著降低了kahweol介導的ATF3表達(Fig.5A、5D);
But,其他激酶抑制劑并不影響ATF3表達(Fig.5B、5C)。
這些數據表明:ERK1/2和GSK3β可能是kahweol介導的ATF3表達的主要上游激酶。

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